使用安捷伦一体化解决方案实现单克隆抗体 N-联糖的高通量分析

作者：Arunkumar Padmanaban 和 Sreelakshmy Menon，安捷伦应用科学家

治疗性单克隆抗体 (mAb) 的糖基化模式对其有效性和安全性至关重要。已知 N-联糖（例如末端半乳糖 (Gal) 残基）会影响抗体的效应器功能 [1]。此外，高浓度甘露糖物质的存在对抗体的药代动力学也有显著影响 [2]。

糖基化模式的表征

对于制造商而言，糖基化模式的表征是法规认证中的一个关键属性。随着生物仿制药的开发 [3]，这些表征研究愈发重要，因为糖基化模式在不同的表达宿主、生产工艺、规模和培养条件下会发生改变。因此在 mAb 的开发过程中，例如克隆筛选和质量控制，需要采用一种高通量方法来提取和分析 N-联糖。

图 1. (A) 采用安捷伦平台进行多糖分离、标记、纯化，以及液相色谱分析的工作流程示意图。安捷伦 AssayMAP 步骤的组成部分以蓝色显示，ProZyme 试剂盒以橙色显示。(B) 展示载样的 96 孔板布局。

mAb 中 N-联糖的高通量样品前处理

本文中，我们展示了使用 Agilent AssayMAP Bravo 平台针对三种治疗性抗体的 N-联糖分析进行样品前处理的情况。为了模拟高通量的用户情境，采用 96 孔板进行样品前处理，每种样品 24 份重复样。抗体包括利妥昔单抗原研药，利妥昔单抗生物仿制药，以及赖氨酸偶联的抗体药物偶联物 (ADC)。通过将 AssayMAP 的微型 (5 µl) 填充微米级色谱柱与具有精确液流控制的 Bravo 96 通道移液头联用，可实现高通量的性能。

首先，将采用 2-AB 试剂盒的 ProZyme GlykoPrep plus 快速 N-联糖样品前处理与 AssayMAP N-联糖样品前处理模块联用进行 N-联糖样品前处理。总工作流程的示意图如图 1 所示。

然后，使用 VWorks 软件套装中的 N-联糖样品前处理：RX 酶解和 2-AB 标记模块设置自动化方案。  

如需该应用的完整信息，请查看安捷伦出版物 5991-6904EN 和 5991-7024EN。

图 2. 利妥昔单抗原研药，利妥昔单抗生物仿制药和抗体药物偶联物的糖基化谱图。

一体化解决方案：Agilent 1290 Infinity LC 和 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱

在本分析中，采用 Agilent AdvanceBio 300 Å，2.1 x 150 mm，1.8 µm 糖谱分析色谱柱对纯化多糖进行分离。Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱可实现多糖物质的快速、高分离度、高重现性分离。这些色谱柱采用 HILIC 酰胺相互作用，可提供更高的分离度、更窄的色谱峰和更高的峰容量。

采用 pH 4.5 的 100 mM 甲酸铵作为水相，乙腈作为有机相进行梯度洗脱，实现多糖的分离。采用该方法，所有的多糖物质均可在 6 分钟内实现分离，缩短了每个样品的分析时间，提高了样品通量（图 2）。采用 HPLC 对每个样品孔释放的多糖进行四次重复分析。安捷伦糖谱分析色谱柱表现出绝佳的重现性标准偏差 (RSD)，峰高和峰面积的 RSD 均小于 6%。这也确证了 Agilent AssayMAP Bravo 平台的高重现性样品前处理性能。如需关于 AssayMAP 平台重现性的详细信息，请查看应用简报 5991-6904EN。

mAb 的 N-联糖分析

接下来针对所有三个样本计算出了每种多糖物质的峰面积百分比。结果如表 1 所示。所有三个样本均表现出相似的 N-联糖分布趋势，其中 G0F 为主要糖型，然后是 G1F、G1F 异构体和 G2F。以原研药和生物仿制药 mAb 的多糖百分比作图，所得关联图表明两者有很高的相似性，其 R² 为 9.73。

表 1. 利妥昔单抗原研药、利妥昔单抗生物仿制药和抗体药物偶联物的 N-联糖峰面积百分比。

选择正确的 N-联糖分析解决方案

上述研究结果展示了一个单克隆抗体的 N-联糖分析的高通量工作流程。该工作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 自动化，减少了人工处理步骤，以优异的精度实现了高重现性，从而简化了样品前处理。Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱可实现高分离度和快速多糖分析。

如需了解关于 Agilent AssayMAP Bravo 平台的更多信息，请观看此网络研讨会。然后阅读我们的宣传册，了解安捷伦自动化解决方案如何帮助业务繁忙的实验室提高通量和工作效率。

参考文献

1. Hamm M, Wang Y, Rustandi R. “Characterization of N-Linked Glycosylation in a Monoclonal Antibody Produced in NS0 Cells Using Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection” Pharmaceuticals, 6, 393–406 (2013).
2. Primack J, Flynn G, Pan H. “A high-throughput microchip-based glycan screening assay for antibody cell culture samples”’ Electrophoresis, 32, 1129–32 (2011).
3. Yoo DH. “The rise of biosimilars: potential benefits and drawbacks in rheumatoid arthritis”’ Expert Review of Clinical Immunology, 10:8, 981-3, (2014).

仅限研究使用。不可用于诊断目的。

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文章目录 — 2016 年 11 月