Access Agilent 电子期刊，2016 年 5 月

使用 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案对治疗性蛋白进行详细分析

作者：Gurmil Gendeh，安捷伦生物制药营销部经理

单克隆抗体和重组蛋白等蛋白类生物药物被广泛用于包括肿瘤和自身免疫性疾病等各种致命性疾病的治疗。蛋白质疗法的复杂性远远超过了小分子药物，而揭示这种复杂性则为分析科学提出了挑战。在本文中，我们通过两个实例介绍了采用 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案的二维液相色谱 (2D-LC) 技术如何为您提供所需的分离能力来应对这些复杂的分离挑战。

单克隆抗体胰酶消解物的深入表征

在治疗性生物大分子的开发过程和使用周期中，详细表征都是必须进行的程序。我们的第一个例子描述了对曲妥单抗进行鉴定和纯度评价的肽谱分析方法。该单克隆抗体 (mAb) 的商品名为赫赛汀，是一种用于治疗乳腺癌的 150 kDa 分子。胰酶消解物给出了理化性质各不相同且浓度动态范围较宽的 100 多个多肽。这一复杂的分析挑战需要最高的分离能力。

全二维液相色谱 (LCxLC) 大大提高了色谱分离度，只要两个维度的分离有良好的正交性，并且在组分转移到第二维时也能保持其在第一维中获得的分离度。将强阳离子交换 (SCX) 和反相液相色谱 (RPLC) 相结合可为多肽分析提供良好的正交性。Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案为该分析提供了最高的性能和可靠性。

图 1. 分析未处理和氧化处理的曲妥单抗的胰酶消解物所得的 LC x LC 等值线图显示了修饰位置

极复杂样品中杂质和修饰的分离

在这一高度稳定的分析中，我们用二维液相色谱检测了曲妥单抗的杂质和修饰。我们进行了强制降解实验，其中我们将曲妥单抗样品置于氧化和高 pH 的条件下进行处理，并分别得到了氧化物和脱酰胺产物。图 1 显示了原样品和氧化处理后样品的二极管阵列检测器 (DAD) 检测结果。降解样品明显包含了更多的斑点。我们选择一个斑点进行了 LC/MS/MS 鉴定。该斑点可以追溯到肽 T41，它是该肽段中蛋氨酸被氧化的结果。

该方法展示了在纯度和同一性评价中具有极大潜力。该组合具有优异的精确性，我们可使用该方法对不同批次的产品，以及原研药和生物仿制药进行质量控制和比较研究。如需了解详细信息，请参阅安捷伦应用简报 5991-2880CHCN 和 5991-4530EN。

图 2. 使用 HIC/RP 二维液相色谱/质谱系统分析 mAb B。氧化后的 mAb 质量为 64 Da，高于未处理的 mAb，这指示有四个潜在的氧化位点

使用质谱进行检测，即使其与您的分离技术不兼容

在第二个例子中，我们将多中心切割 (MHC) 二维液相色谱/质谱与疏水相互作用和反相色谱相结合，对治疗性蛋白质进行了分析。疏水相互作用色谱 (HIC) 是 mAb 下游处理和分析型分析的常用方法。这类研究通常需要用质谱进行质量数测量以获得有利信息，但 HIC 分离所用的高盐条件与电喷雾电离 (ESI) 完全不能兼容。Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案克服了这一问题，该方案采用多中心切割技术并使用与 TOF MS 串联的反相 (RP) 色谱进行后续的脱盐/分离。有关这些实验的信息，请参见安捷伦应用简报 5991-6376EN，其中使用了配备双喷雾器 ESI 离子源的 Agilent 6224 精确质量 TOF LC/MS 系统。

重叠峰的精确质量测量

我们还对 mAb B 进行了氧化处理，并得到了比 12.5 分钟处的 mAb 主峰早 0.5 分钟洗脱的色谱峰（图 2A）。我们使用多中心切割分别选择这两个色谱峰，并通过二维液相色谱/质谱进行质量测量。正如预期，氧化产生的峰的质量数高于 mAb 峰（图 2B 和 2C）。在这个例子中，质量数高出 64 Da，与四个位点处的氧化反应相一致。基于对该分子已有的知识，我们认为这些氧化反应很可能发生在 mAb 中的四个蛋氨酸残基上。

克服分离时间的限制

您可以通过 MHC 切割并保存第一维中感兴趣的区域，以便可以分配任何所需的时间进行第二维的优化分离。在本工作中，我们分配了足够的时间以进行样品脱盐并以相对低的流速 (0.2 mL/min) 灵敏地将样品引入质谱。即使质谱分析不需要脱盐，MHC 型二维液相色谱也可以执行更长的二维梯度分离，这是蛋白质样品分析中经常需要的。

优化挑战性的液相色谱分离

Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案为蛋白质生物药物等复杂样品的分析提供了您所需的终极分离度。如需了解更多信息，请观看关于如何轻松使用二维液相色谱的视频并阅读《分析化学》中关于治疗性利妥昔单抗的二维液相色谱/质谱分析的文章。请联系安捷伦客户服务代表，了解关于二维液相色谱的更多信息。