Access Agilent 电子期刊，2015 年 3 月
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用于生物治疗药物分析的有效方法
作者：Sonja Schneider、Xiaomi Xu 和 Phu Duong
安捷伦应用科学家
在生产和纯化期间，由于氨基酸取代、糖基化、磷酸化，以及其它翻译后或化学修饰作用，生物治疗性抗体会在电荷异质性上出现变化。蛋白质分析中，在给定 pH 下发生电荷变异，说明其分子一级结构出现变化，从而导致其它蛋白质构象产生。这些变化会影响药物的稳定性和活性，或者引起免疫不良反应。电荷异构体的分析是生物药物开发中的关键因素。本文中，我们的专家团队介绍了一些检测方法，以加深您对生物治疗药物分析的理解。
糖基化分析的重要性
重组治疗性糖蛋白的糖基化谱图是一个重要参数，它会影响糖蛋白的安全性、有效性和一致性。除了采用 HILIC 进行糖基化模式分析外，还可利用阴离子交换色谱评估糖链电荷谱图。N-糖链的电荷谱图展现了包含不同数目阴离子糖类的 N-糖链的分布，它可能包括中性、单-、双-、三-、四-，以及更高带电数目的糖链结构。糖链带电通常是因为含有唾液酸，或者由于糖链结构中单糖单元的磷酸化或硫酸化，但这比较少见。
哺乳动物细胞表达的蛋白质上连接的 N-糖链有两种类型的唾液酸残基，即 N-乙酰-神经氨酸 (NeuAc) 和 N-羟乙酰神经氨酸 (NeuGc)。这些结构通常连接到 N- 和 O-连接糖链非还原端的半乳糖残基上。在人类蛋白质中，正常唾液酸化作用利用的是 NeuAc，而 NeuGc 出现在非人类哺乳动物蛋白质中，不能用做治疗性糖蛋白。糖链电荷谱图是用于监控生物治疗性蛋白的一个重要参数，是 HILIC 分析的重要补充，可以加深我们对唾液酸化作用的理解，并识别潜在不良唾液酸残基是否存在。
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图 1. 牛胎球蛋白的电荷谱图。图中结构是不同电荷/唾液酸化 N-糖链的一些实例，通常出现在胎球蛋白中
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图 2. 使用 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱和 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱分离完整和羧基端酶解的 IgG1
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图 3. 羧基端酶解 IgG1 的组成
在我们的第一个实例中，胎球蛋白的 N-糖链被酶切，随后采用 2-氨基苯甲酰胺进行标记，然后再采用 HILIC 小柱进行净化。糖链电荷谱图的测定采用 Agilent Bio SAX 色谱柱和 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱。图 1 展示了牛胎球蛋白的电荷谱图，分离了中性（峰 1）、单-（峰 2）、双-（峰 3）、三-（峰 4）、四-（峰 5），以及五-唾液酸化（峰 6）的 N-糖链。紧邻峰的结构表示了分别带有 0-5 个唾液酸的不同电荷的糖链，这通常出现在牛胎球蛋白中。色谱峰得到很好的分离，并且分析具有优异的精密度，保留时间和峰面积精度的相对标准偏差分别小于 0.002% 和 10%。如需了解更多有关该分析的信息，可查看免费安捷伦出版物 5991-5221EN。
采用安捷伦色谱柱进行高分辨 IgG1 分析
单克隆抗体/IgG1 (mAb) 是一种生物治疗药物，在过去 10 年间得到广泛应用。然而由于其结构较为复杂，IgG1 常常表现出高度的异质性，这种异质性包含了各种各样的翻译后修饰。其中，常见的是重链上羧基端不同水平的赖氨酸修饰。羧基端赖氨酸变体异质性的程度能够反映生产的一致性，因此有必要对其进行评估。阴离子交换 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱提供了实现高分辨 IgG1 分析所需要的选择性，尤其是用于 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱中时。
在本研究中，我们使用羧肽酶 B 从 IgG1 的羧基端来裂解碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。通过比较完整和羧基端酶解 IgG1 的色谱图，可以鉴定出 IgG1 羧基端赖氨酸的连接情况。图 2 展示了完整和羧基端酶解 IgG1 的叠加色谱图。上面是完整的色谱图，下面是局部放大图。大约在 2 min 时最先流出羧肽酶 B。有 4 个来自原始 IgG1 的碱性变体峰，以及来自 lys-1 和 lys-2 赖氨酸变体的两个峰。这些变体的峰面积分别约占总峰面积的 8.64% 和 1.34%（图 3）。连续进样 10 次 IgG1，检测分析的重现性。结果表明，保留时间、峰形和峰面积都高度一致。查看安捷伦应用简报 5991-0895CHCN，以获取本研究工作的完整信息。
安捷伦为生物治疗药物分析提供了多种不同的解决方案
如示例所讨论，Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统可实现良好的峰形，轻松应对具有挑战性的溶剂条件，如 1 - 13 的极端 pH 值，以及高盐浓度的缓冲液。含耐腐蚀钛的溶剂输送系统和无金属材料的样品流路使系统非常稳定，可获得准确的检测结果。
安捷伦生产的仪器值得信赖，可提供准确、可重现的结果。请立即花一点时间来了解我们为生物制剂和生物仿制药提供的多种不同的解决方案。然后联系您当地的安捷伦客户服务中心，索取我们最新挂图的免费副本：实现蛋白质准确表征的一整套工具。
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