Access Agilent 电子期刊，2016 年 11 月

采用安捷伦 AdvanceBio SEC 色谱柱对 mAb 和 ADC 进行快速高通量体积排阻色谱分析

作者：M. Sundaram Palaniswamy，安捷伦应用科学家

蛋白质通常在暴露于压力条件下时发生聚集，例如 pH、温度或浓度的变化。因此，不同生产阶段均有可能发生聚集，包括上游、下游或仅存储过程。

体积排阻色谱 (SEC) 是监测和表征单克隆抗体和抗体药物偶联物 (ADC) 聚集体的首选方法。然而，SEC 分离通常在相对较低的流速下采用较长色谱柱进行，分析时间通常较长。

另一种选择是，采用配备亚 2 μm 的超高性能液相色谱 (UHPLC) 来克服这些难题，结果表明分析时间大大缩短。然而，当应用非常细小的填料和较高流速时，热力和剪切力可能对于温度或压力敏感的蛋白质至关重要。[1]。

由于其具有潜在的免疫原性，因此重组蛋白质的生产过程中必须对聚集体浓度进行彻底控制。本文探讨了应用短柱长小孔径的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱对 mAb 和 ADC 实现快速的高通量 SEC 分析。

图 1. 原始利妥昔单抗创新药物和生物仿制药、赫赛汀以及 ADC 在 Agilent AdvanceBio SEC 300Å, 7.8 × 150 mm, 2.7 µm 色谱柱上的 SEC 色谱图。

图 2. 原始利妥昔单抗创新药物和生物仿制药、赫赛汀以及 ADC 在 Agilent AdvanceBio SEC 300Å, 4.6 × 150 mm, 2.7 µm 色谱柱上的 SEC 色谱图。

本研究的目的是通过缩短运行时间来提高分析通量。流速决定了给定色谱柱尺寸的 SEC 运行时间。然而，在较高流速下，分离度可能会受到影响。为获得更短的运行时间，需要降低色谱柱死体积与流速的比例。

缩短柱长和提高流速是加快 SEC 分析的一种直接方法。[2,3] 利妥昔单抗创新药物和生物仿制药、赫赛汀以及 ADC 在 Agilent AdvanceBio SEC，7.8 x 150 mm 色谱柱上的色谱图表明，在色谱条件下（如图 1 所示），单体可在 4 min 内实现出色的洗脱。

为了获得更高的灵敏度，采用 AdvanceBio SEC，4.6 × 150 mm 色谱柱进行了分离，结果表明其具有如图 2 所示的卓越分离性能。在上述两种情况下均不存在早洗脱或晚洗脱峰，说明市售 mAb 制剂呈均质，且没有发生聚集或降解的迹象。

利用上述两种色谱柱与水性流动相对疏水性 ADC 进行分析可获得对称峰，表明疏水性有效载荷与固定相担体之间不存在次级相互作用。

SEC 广泛用于蛋白聚集体的高准确度表征。本文中我们展示了使用短柱长小孔径并填充以 2.7 µm 填料的 Agilent AdvanceBioSEC 色谱柱可在 4 min 内对单体、聚集体和片段实现高通量分离。AdvanceBio SEC 色谱柱可为疏水性 ADC 提供出色的峰形。

该方法具有优异的峰面积和保留时间精度，表明其对于常规分析具有较高的可靠性。此外，短柱长小孔径的 AdvanceBio SEC 色谱柱能够可靠地监测聚集体和片段。这是通过测定色谱柱适用性的强制压力研究来完成的，该情况下需要高通量和高灵敏度。

如需了解关于应用短柱长小孔径的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱对 mAb 和 ADC 实现快速的高通量 SEC 分析的更多详细信息，请参考安捷伦出版物 5991-7165EN。

Szabolcs Fekete, Alain Beck, Jean-Luc Veuthey and Davy Guillarme, “Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 101 (2014) 161–173
S. Park, H. Cho, Y. Kim, S. Ahn, T. Chang, “Fast size exclusion chromatography at high temperature”, J. Chromatogr. A 1157 (2007) 96–100.)
Andrew Coffey，使用快速高分离度体积排阻色谱柱分析生物治疗药物中的聚集体，安捷伦应用简报，5991-6458CHCN，2015 年 12 月 11 日。