Access Agilent 电子期刊，2016 年 2 月

Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱可解决糖谱分析难题

Vicki Pandey，安捷伦全球营销传播部门

单克隆抗体 (mAb) 的糖基化是一种常见的翻译后修饰。这些糖蛋白生物药物包含复杂的寡糖链，这些寡糖链的存在、缺乏、连接位点和相对丰度特征对于药物的效力、药代动力学、免疫原性、折叠和稳定性具有显著影响。

多糖基团在免疫原性、效应或功效以及 mAb 的清除中具有关键作用。重组蛋白治疗药物的稳定性需要在整个保质期中长期监测某些重要修饰的产物，例如糖基化。可在完整蛋白上进行糖基化分析，但是必须进行糖肽谱分析，糖肽谱分析可提供额外的重要信息，例如序列信息、质量分析及糖基化位点的鉴定。

为了应对这些挑战，我们测试了用于糖链结构表征及糖基化谱监测的一些具体解决方案，其中使用了安捷伦液相色谱柱、液质联用和液相色谱系统。

采用集成的安捷伦解决方案可实现快速糖基化表征

为了表征来源于 CHO 细胞的 IgG，我们首先采用了一种快速高效的液相色谱飞行时间质谱方法。其中使用了 Agilent Poroshell 300SB-C3，5 µm 表面多孔色谱柱，获取完整 IgG1 糖型的精确质量数，并进一步分了析木瓜蛋白酶消化的 IgG1 以获取 Fc 区域的位点特异性糖基化谱信息，最后深入表征 IgG1 的异质性。

在本应用简报中，我们使用了配有二极管阵列检测的 Agilent 1200 Infinity 液相色谱系统和 Agilent 6224 TOF LC/MS。此外，我们随后使用 mAb-糖链芯片 LC/MS 分析建立糖链精确质量数数据库，用于进一步验证 TOF 质量数分析中鉴定出的糖链。

图 1. IgG1 经木瓜蛋白酶消化后进行反相色谱分析所得的两个主要色谱峰为 Fc 和 Fab 碎片。插图详细描述了 Fc 和 Fab 碎片变异体部分分离的色谱峰（箭头所指）

图 2. 采用 2.1 × 250 mm, 2.7 µm 安捷伦 AdvanceBio 肽图分析色谱柱所得的 rhEPO 反相色谱肽图

图 1 展示了在反相色谱中裂解后的分离图和条件。在不到 3 分钟的分离中，在 2.4 和 2.7 分钟各有一个主峰，分别为 Fc 和 Fab 的碎片。此外，在 Fc 区域附近，2.1 到 2.5 分钟之间有一些更小的部分分离峰，为 Fc 碎片的变异体。

如需了解糖基化表征方法的详细信息，请查阅安捷伦出版物 5991-2323EN。

高分离度糖肽谱分析

然后，我们评估了采用表面多孔技术的安捷伦 AdvanceBio 肽图分析色谱柱（2.7 µm 粒径）。该色谱柱经特殊设计用于肽图分析应用，可显著提高多肽的分离度。我们采用了与第一个例子相同的 LC/MS 仪器设置。

图 2 展示了 2.1 × 250 mm 色谱柱以及优化后的色谱条件（采用甲酸作为离子对添加剂）可实现 rhEPO 胰酶消化物的高分离度分离。分离图展示了在整个梯度时间内的极窄峰宽、高灵敏度和高选择性，说明该分离极其适用于 ESI/MS 分析。

查看安捷伦出版物 5991-1813CHCN，深入了解 AdvanceBio 肽图分析色谱柱在糖肽图分析中的应用。

图 3. 2-AB 标记的胎球蛋白的分离

表 1. N-糖链卵清蛋白的详细信息

实现抗体的高效分析

最后，我们使用配备安捷伦 AdvanceBio 糖链图分析色谱柱的 1290 Infinity 二元液相色谱以及 Agilent 6530 精确质量数 Q-TOF LC/MS 检测 mAb 的 N-糖链及其他糖蛋白。实验通过 PNGase F 将胎球蛋白和卵清蛋白质中的 N-糖链裂解下来，以 2-AB 进行衍生化反应并采用配有在线 MS 的 HILIC/UHPLC 进行分析。图 3 展示了牛胎球蛋白的糖基化谱图，主要为含 NeuAc 的复杂非岩藻糖基化二分支或三分支糖链。采用 Q-TOF/MS 检测可实现对 9 个主要峰的归属。表 1 展示了已归属的糖链结构。

查阅安捷伦出版物 5991-5253CHCN，了解使用 UHPLC 和荧光检测进行 N-糖链分析的详情。

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