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全新的 Agilent HILIC 色谱柱有助于改善 N-连接糖链的分离度并实现快速分析

作者：James Martosella
安捷伦生物应用

最大一类药用蛋白质由重组单克隆抗体 (mAb) 制成。 为了增强药效，mAb 必须具有正确的糖基化模式。人类 mAb 的每条重链上具有一个保守的 N-连接糖基化位点。N-连接糖基化是一种至关重要且极其复杂的翻译后修饰方式。因此，在药用糖蛋白的整个开发、加工和生产过程中需要对这种修饰方式进行严格控制和监控。

药用蛋白质特性（包括安全性、药效和血清半衰期）受其糖基化方式差异影响，因此分析这些糖基化方式是表征药用糖蛋白（特别是 mAb）的重要环节。

糖基侧链更为普遍地被称作支链寡糖。对糖链的分析可采用不同策略。然而，大多数方法是基于 mAb 的蛋白质酶解释放出糖链，然后用标记试剂（例如 2-氨基苯甲酰胺，2-AB）进行衍生化处理。由于糖链缺少生色团，因此采用 2-AB（中性物）进行标记有利于荧光检测。标记的糖链具有强亲水性结构，其首选分离技术为亲水相互作用色谱法（常称作 HILIC）。通过采用荧光检测的 HILIC 进行分离是一种强大的糖基化分析方法，而 HILIC/LC 还可以与质谱仪联用以获得重要的质量数和结构信息。

速度是关键因素

然而，HILIC/LC 所面临的日益严峻的挑战之一则是在快速分析时间内实现高分离度分离。随着生物表征领域更高通量分析需求的日益增长，研究人员期望获得更优的分离 (HILIC) 方法，但不希望损失分离性能。由于糖链包括许多密切相关的结构，因此获得最高的分离度至关重要，在快速分析过程中更是如此。

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图 1. 在 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱上分离带有 2-AB 标记的 N-连接人类 IgG 糖链

为应对这类分离，安捷伦推出了 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱，其能够实现糖链的高分离度分离。Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱以 1.8 µm 全多孔填料为基础，采用创新的酰胺键合固定相。该色谱柱能够高分离度地分离糖链结构，与常用的 HILIC 流动相和操作条件具有良好的兼容性。它还经过优化，可日常用于 UHPLC/MS 和荧光检测，实现糖链（尤其是 mAb 生成的糖链）的可重现、可靠且快速的分离。

为证明这种分离性能，使用一根 2.1 x 150 mm 的 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱对人类 mAb 糖链进行分析。图 1 中，使用 HILIC 对人类 IgG 中 2-AB 标记的糖链进行分离。使用荧光和质谱检测器对该分离进行监测。在此分离过程中，标记的糖链可实现高度分离，峰形完美，具有较高的灵敏度。该色谱柱具有稳定的基线性能和窄峰宽，可以准确检测相邻的洗脱峰。糖链分析色谱柱与 ESI-QTOF MS 仪联用，可准确识别峰 1 到峰 9的糖链。（表1）。这充分说明了这种色谱柱具有独特的功能，可快速高效地分析人类 mAb 糖链，有助于生物治疗药物的表征。

#	糖链鉴定	结构
1	G0F/FA2
2	G0FB/FA2B
3	NA2G1F/ 1,6 G1F/F(6)A2[6]G(4)1
4	NA2G1F/ 1,3 G1F /F(6)A2[3]G(4)1
5	G1FB/FA2BG1
6	G2/A2G2
7	G2F/FA2G2
8	G2FB/FA2G2B
9	A1F/FA2G2S1

表 1. 峰序号、糖链鉴定和结构

进一步改善工作流程

一般来说，N-糖链的样品前处理耗时耗力，且通量较低，通常需要花费几天时间。Agilent AssayMAP N-糖链样品前处理系统现采用 ProZyme 解决方案，为 N-糖链样品前处理提供了自动化、高稳定性和高通量的制备过程，只需要很少的操作时间。与过去耗时几天不同，现在的样品在几小时内即可使用。

Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱和 Agilent AssayMAP 仅是安捷伦用于确认蛋白质序列、鉴定修饰和常规蛋白质指纹监测解决方案完整产品系列中的两项。请访问蛋白质表征的准确解决方案，了解全系列产品信息。

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