荧光光谱概述

在荧光光谱法中，使用具有样品化合物能够吸收的能量的单色光（通常是紫外或可见光）来照射样品。样品吸收这些激发光子后，分子从其基态被激发到激发电子态。随后，分子回到基态，相应的能量以光子的形式释放出来，使分子发出荧光。检测并分析这些光子的强度和频率，利用这些信息确定分子振动能级的结构（见图 1）。这样我们就可以对分子进行定性和定量，了解分子是否发生任何变化，它如何与同一样品中的其他分子相互作用，以及其他更多信息。由此产生的应用非常广泛，将在之后的常见问题解答中进行介绍。

荧光光谱法主要是指分析样品的荧光，但其中的大部分也适用于磷光。

荧光光谱与样品浓度

荧光光谱法最重要的应用之一是确定未知样品的浓度。要做到这一点，我们需要知道样品浓度与其荧光信号强度之间的关系。那么，是什么决定了样品的荧光强度呢？

可想而知，荧光信号取决于受激发化合物分子的数量（图 3）以及一个用于描述激发态分子发光可能性的常数。

F ≈ • (处于激发态的分子数)

图 3. 荧光强度与样品中的激发态分子数成正比。

这一常数 ( ) 称为荧光量子效率，是化合物发射光子与吸收光子的比率。化合物的荧光量子效率越高，发出荧光的能力就越强。

达到激发态的分子数量在很大程度上取决于光源强度。照射到样品的光越多，样品吸收的光也就越多。不过这也取决于化合物吸收光的能力。化合物吸收某种能量的光的能力用吸收系数 (ε) 来描述，这便是吸收光谱的基础。

这意味着，可以用样品的入射光 (I₀) 和透射光 (I) 之间的强度差来描述达到激发态的分子数。

（达到激发态的分子数）= I₀ – I

利用朗伯比尔定律 (I = I₀ • 10^-εlc)，样品透射光的强度又可以写作：

（处于激发态的分子数）= I₀ – I₀ • 10^-εlc = I₀ • (1-10^-εlc)

最后得到：

F = • I₀ • (1-10^-εlc)

因此，利用朗伯比尔定律将荧光信号强度与样品浓度联系起来了。然而，这种关系只对低浓度样品呈线性（图 4）。一般来说，如果光密度 (OD) 小于 0.05，则荧光信号与浓度保持线性关系（在每本关于荧光的“最佳实践”书籍中都有提及 0.05 的 OD）。

非线性的信号-浓度关系仍然可以用于根据荧光强度确定未知样品浓度。但是，在这种情况下，构建校准曲线要非常严谨，并意识到这个问题。

图 4. 荧光强度与样品的浓度/光密度 (OD) 不呈线性关系。荧光强度随浓度呈指数增长（蓝色），偏离线性曲线（红色）。对于低浓度样品（OD < 约 0.05），浓度和荧光强度之间的关系几乎接近线性。线性曲线（红色）和实际的指数曲线（蓝色）在 0.05 OD 以下基本一致。

荧光光谱法的主要原理通过这些常见问题解答进行了更详细的描述，但可概括如下：

• 吸收和激发 — 分子吸收光能，促使电子达到更高能级。
• 荧光发射 — 分子将吸收的能量以更长波长的光的形式释放。
• 斯托克斯位移 — 吸收光与发射光之间的能量差揭示了分子性质。
• 量子产率 — 衡量发射光与吸收光相比的效率。
• 荧光寿命 — 分子返回基态前处于激发态的平均时间。
• 强度和光谱 — 荧光强度和发射光谱提供了有关样品性质的关键信息。
• 淬灭和 FRET — 由于分子间或分子内的相互作用或能量转移导致的荧光减少。
• 荧光各向异性 — 衡量发射光的偏振，指示分子运动或能量转移。

荧光光谱法具有许多变体，每种变体设计用于研究荧光分子的不同方面及其相互作用。一些主要类型包括：

• 稳态荧光 — 最常见的类型。照射样品并测量作为波长的函数的发射光强度，提供有关量子产率和荧光分子浓度的信息。这一类别可进一步分为共振和非共振荧光。共振荧光中的发射发生在与激发相同的波长处，而非共振荧光发射在与激发不同的波长（通常更高）处。Agilent Cary Eclipse 双单色器、双滤光片、90 度检测设计和超亮闪烁式氙灯非常适合这些应用中的任何一种。
• 时间分辨荧光 — 研究荧光发射随时间推移的衰减。它提供有关荧光寿命的信息，可用于研究分子动力学、能量转移和相互作用。时间分辨荧光通常需要非常快速的检测系统来准确捕获发射曲线，并且 Cary Eclipse 能够以快至 1 μs (1 MHz) 的采集速率进行采集。当寿命超过 50 μs 时，可以获得良好的结果，从表征寿命 100 μs 及更长时间所得到的结果具有高可信度。
• 各向异性光谱法 — 测量发射光的偏振，以研究分子运动、旋转动力学和结合相互作用。Cary Eclipse 在研究生物分子及其相互作用方面特别有用，它同时具有专用的自动偏振片和手动偏振片附件，是这些类型测量的理想选择。
• FRET 光谱法 — 研究供体荧光团与附近受体荧光团之间的能量转移。用于研究分子相互作用、构象变化以及分子之间的距离。这些研究通常需要高精度温度控制。安捷伦出众的 Cary Eclipse 帕尔帖温度控制器，能够在 –10 °C 至 100 °C 范围内保持 ±0.05 °C 的稳定性，非常适合这项任务。
• 荧光相关光谱法 (FCS) — 以小体积分析分子扩散和相互作用。提供有关分子淌度、浓度和结合动力学的信息。用于这些研究的理想附件包括 RX2000 快速混合附件和 SFA-20 停流附件，这两种附件均适用于 Cary Eclipse。这些附件提供了实时记录荧光，同时将小体积的两种试剂快速混合在一起的出色方法。
• 单分子荧光 — 研究单个分子，提供有关单分子水平上的异质性、动力学和相互作用的信息。
• FLIM（荧光寿命成像显微镜）— 将荧光显微镜与时间分辨荧光相结合，以实现基于荧光寿命的相互作用和过程的可视化。
• TIRF（全内反射荧光）— 利用隐失波照明选择性地激发表面附近的荧光团。常用于研究细胞膜上或附近发生的过程。

在学术研究和实际应用中，荧光光谱法是一项非常有用的技术。荧光光谱可以提供关于分子的电子状态（如能量、极性）、吸收光后发生的各种过程（如能量转移、弛豫、系间跨越）及其时间尺度的详细信息。这些信息不仅具有学术意义，而且在选择 LED 或太阳能电池等光电设备的材料时也很重要。除了使用荧光光谱研究特定分子的光谱性质，其也用作分析工具。如需了解更详细的信息，请阅读或查看我们的荧光光谱应用指南。

荧光光谱法的应用可以大致分为两类：化学与材料（包括学术方面）以及生命科学。在生命科学领域，近年来对荧光仪器的使用大大增加，特别是在细胞分析等应用领域。

有些分子天然发射荧光，还有些分子是人为设计合成的，可在某种条件下以某种形式发射荧光，可用于特定用途。荧光材料包括：

• 蛋白质和多肽（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）
• 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)
• 核黄素
• 叶绿素
• 量子点
• 奎宁
• 矿物，如方解石、磷灰石、刚玉等
• 荧光染料，如罗丹明、BODIPY、荧光素等

化学与材料应用

荧光光谱技术可用于监测涉及荧光反应物和/或产物的反应，该技术的优点包括取样灵活（例如，使用光纤探头直接在反应瓶中进行检测）、超快速扫描（有利于分析短寿命物质）。更多涉及荧光材料的具体应用包括：

• 检测洗衣粉中荧光增白剂的荧光
• 检测难测量的固体样品的荧光，如钟乳石和活珊瑚
• 表征新合成材料的发射性质，了解其电子特性（用于光电应用）
• 检测水样中的多环芳烃以及分析水样中的溶解性有机碳

生命科学应用

荧光光谱技术用途广泛，能够进行动力学测量、检测细胞内的离子浓度、搭配偏振滤光片分析分子转动、精确控制样品温度，为生命科学应用提供了强大的工具。应用示例包括：

• 表征用于活细胞成像的生物-标记物
• 表征 GPCR 低聚反应
• 使用荧光检测法检测特定的细菌菌株
• 通过细胞信号转导了解血小板反应
• 分析蛋白质三级结构的变化
• 确定生物催化剂和药物的热稳定性
• 确定 DNA 样品和 RNA 样品的熔解温度 (Tm)
• 识别聚集的生物分子，如单克隆抗体
• 测定细胞内分析物的浓度
• 荧光免疫分析的结果读取

如需了解更多关于以上生命科学应用的信息（包括同行评审出版物的链接），请参阅 Cary Eclipse 荧光分光光度计应用指南。

图 5. Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计具备抗室光干扰特性，能够与光纤取样无缝集成。光纤探头可用于在仪器样品室外进行远程测量，从而轻松分析体积太大而通常无法放入仪器的样品，此外还具有浸入式光纤探头，无需再使用样品池。

涉及荧光、磷光、生物发光和化学发光的检测都可以用荧光分光光度计或荧光光谱仪完成。实际上这类仪器有几个术语经常互换使用，包括分光光度计和荧光仪。荧光光谱技术本身也经常被称为荧光光谱测定法，有时也被称为荧光测定法。

荧光分光光度计通常使用单色器来选择特定激发波长以及确定发射光波长。更简单的“滤光片荧光仪”系统使用光学滤光片来实现同样的目的，而滤光片需要根据所需的激发波长和发射波长进行更换。

荧光仪器检测类型多样，在全世界的分析实验室都非常常见。它们还可以与多板微孔板检测仪或光纤探头等附件搭配，实现更高的灵活性。

图 6. Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计。

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计可进行荧光、磷光、化学发光和生物发光检测。安装光纤探头、温控装置、固体样品处理等附件，可以实现远程测量，还可以加入微孔板检测仪，提高样品通量。

在荧光分光光度计中，使用具有样品化合物可以吸收的能量的单色光照射样品。样品则向各个方向发光，然而，市面上大多数光谱仪都在与激发光成 90° 角的方向上检测发射光。这有助于减少来自光源本身的干扰。检测器系统分析发射光的强度并解析其波长分布。因此，现代荧光分光光度计使用两个单独的单色器。一个用于准确选择光源的激发波长，另一个用于分析发射光（图 7）。

图 7. Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计简化了仪器设置。在与激发光成 90° 角的方向上检测发射光。现代荧光分光光度计使用两个单独的单色器 — 一个用于选择激发波长，另一个用于分析发射光。

光源、单色器和检测器

现代荧光分光光度计使用一系列不同的光源。激光光源能精确发射固定波长的光，而传统汞灯性价比高，不过光照强度不太稳定，需要经常更换。Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计采用闪烁式氙灯，可闪烁 30 亿次（通常可使用 10 年）。对小体积珍贵样品或高度敏感的生物样品进行检测时，不会出现样品光降解的情况，仪器的抗室光干扰特性意味着可以在仪器样品室外进行检测（例如，使用光纤探头）。

使用单色器可在激发和发射阶段选择特定波长的光。单色器使用衍射光栅将一束光分解为组成该光束的各个波长的光，各波长的单色光从不同角度射出单色器。通过衍射光栅的精确运动，就可以选择波长。此外，出色的衍射光栅涂层设计也有助于确保整个波长范围内的灵敏度。

单色器驱动装置的设计保证 Cary Eclipse 在 24000 nm/min 的扫描速率下无峰位漂移。光栅仅在灯关闭时移动，可称为“go-stop-flash”（移动-停止-闪烁）检测模式。在检测过程中，波长保持不变。Eclipse 还在两个单色器上内置了滤光片，可大大减少散射或排除二阶杂散光。通过在各个单色器上添加自动偏振滤光片，可以检测荧光偏振（或荧光各向异性）。

光电倍增管 (PMT) 常用作荧光分光光度计的检测器，因为它们非常适合检测低强度的光。在 PMT 检测器中，入射光子会引发二次电子发射级联，从而产生可进行检测的强电流。

Cary Eclipse 采用红光敏感型光电倍增管 (PMT) 检测器，可在不牺牲紫外 (UV) 检测性能的情况下将高灵敏检测性能拓展至 900 nm。Eclipse 在光谱的可见区具有出色的灵敏度 — 这一特性非常重要，因为许多荧光染料和标记物的发射光都在可见区。Eclipse 在紫外区也有很高的灵敏度，可以检测重要的氨基酸，如色氨酸和酪氨酸。还有另一种 PMT 检测器可供选择，用于提高对 700 nm 以上波长的灵敏度。

了解更多信息：

• 技术概述 — 使用 Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计获得的荧光素的线性动态范围和检测限
• 技术概述 — 使用 Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计进行各向异性测量

荧光检测可分为两大类：

1. 发射检测 — 用固定波长的光照射样品。检测器在一定的波长范围内进行扫描并检测发射出的光子的强度。由此获得各发射波长以及相应发射光强度的发射光谱。
2. 激发检测 — 用一系列波长的光照射样品。检测波长固定。由此得到的激发光谱给出了使样品在指定的发射波长下发出荧光所需的激发波长。

荧光光谱通常会根据温度和浓度的变化而变化，此外还受溶剂效应和许多其他因素的影响。将发射和激发光谱结合起来，可以获得三维发射图。三维发射图描述了各激发波长和发射波长下的发射光子强度（图 8）。

图 8. 荧光激发-发射矩阵 (EEM) 等值线图。

荧光分光光度计可进行多种类型的检测，包括：

• 荧光各向异性分析
• 时间分辨荧光
• 温控荧光
• 荧光共振能量转移 (FRET)
• 磷光寿命或延迟荧光检测
• 磷光、化学发光和生物发光研究 — 请参见后续问题

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计是一款用户友好型系统，配备 Cary WinFLR 软件，用于仪器控制和数据分析。自动化工作流程非常适合大多数用户，软件还包含许多高级功能，供专家级用户使用。

荧光光谱法具有显著优势，使荧光光谱仪成为大多数光谱实验室不可或缺的分析工具：

• 荧光光谱法非常灵敏。大多数情况下，它的灵敏度是吸收光谱法的大约 1000 倍。例如，Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计的荧光检测限为 0.48 pmol/L。
• 荧光光谱法是一种无损检测技术。不同于质谱等技术，在大多数情况下，样品在完成荧光检测后仍保持完好。在极少数情况下，高能紫外光会使样品发生光降解，不过，Cary Eclipse 不同于其他大多数荧光分光光度计，其使用闪烁式氙灯，只有在进行检测时才会照射样品，从而避免了光降解。
• 荧光光谱法具有高选择性。荧光实验中有两种分析波长 — 激发波长和发射波长。只有吸收激发光并发射出特定波长的光的化合物才能被检测到。所有其他不吸收入射光或发射不同波长的光的化合物都不会影响所采集的信号。这样，我们就可以非常有选择性地只分析目标化合物。
• 荧光光谱法信息丰富。荧光实验可以提供定性和定量信息：
  • 浓度：荧光信号与样品中发光物质的浓度有关。
  • 检测：荧光光谱法非常灵敏，可以检测痕量物质。
  • 表征：发射光谱提供了电子基态的信息，而激发光谱提供了电子激发态的信息。
  • 样品环境：许多发色团的发射情况会随环境的变化而变化，例如，温度、pH 值或溶剂（溶剂化显色）。这种效应可用于监测发色团周围直接环境的改变（例如，在构象变化过程中极性的变化可能导致发射光的能量或强度发生变化）。
  • 过程：荧光可以帮助人们理解激发后发生的过程。偏振检测有助于分析聚集或能量转移过程。淬灭研究常用于生命科学领域来考察蛋白质和经标记的 DNA/RNA 的行为。
• 荧光光谱法的用途非常广泛。荧光仪器可以进行多种荧光、磷光、化学发光和生物发光检测。通过增加合适的附件，可以让这些仪器的使用更加灵活。Cary Eclipse 荧光分光光度计可搭配一系列附件，用于液体、固体、粉末和糊剂，包括：
  • 用于方法开发或高通量检测的微孔板检测仪
  • 用于快速准确测量样品的光纤探头和耦合器，无需样品池
  • 用于精确控温的帕尔帖和水浴恒温单池和多池支架
  • 用于准确测量样品池内部温度的温度探头
  • 用于研究几秒内完成的超快反应动力学测量的快速混合附件
  • 手动和自动偏振器，激发波长低至 275 nm
  • 用于采集多种样品类型（包括过滤物、粉末、凝胶、光学元件和织物）荧光光谱的固体样品支架
  • 反射光纤探头与耦合器

图 9. 用作筛查工具的 Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计，配备微孔板检测仪。

荧光光谱法虽然是一种强大的技术，但也存在某些优点：

• 自发荧光/生物发光/化学发光 — 一些样品（特别是生物样品）由于内源性荧光团而自然发出荧光，这会干扰靶向分子的分析。然而，Cary Eclipse 具有专用的“生物发光/化学发光”模式，可测量天然荧光物质。该模式禁用样品的激发，并记录其天然荧光图谱。
• 光致漂白 — 连续暴露于激发光可能引起光致漂白，其中样品的荧光强度随时间推移而减弱，影响测量的可靠性。Cary Eclipse 通过使用闪烁式氙灯光源（以 80 Hz 的频率闪烁）缓解了这一问题（与一直处于工作状态的稳态灯相比）。而且该灯仅在数据采集期间闪烁，否则保持关闭状态。
• 穿透深度有限 — 与红外技术相比，基于荧光的技术以及紫外-可见-近红外技术一般而言具有有限的穿透深度。这使得它们不太适合厚度或不透明度较大的样品。
• 环境敏感性 — 荧光对温度、pH 值和溶剂组成等环境因素敏感，这些因素会影响分子的荧光性质。
• 样品复杂性 — 在复杂样品中，可能发生重叠荧光信号，并且由于许多荧光发射的光谱范围宽，因此区分单个信号可能具有挑战性，导致数据解释的不确定性。
• 荧光团附着效应 — 向分子中添加荧光标记可能会改变其性质、相互作用或行为，可能引入伪峰。
• 淬灭和相互作用 — 荧光可通过与其他分子的相互作用而淬灭（还原），并且此类相互作用不一定容易解释。
• 伪峰生成 — 不正确的样品前处理、不适当的标记方法或仪器设置可能生成歪曲结果的伪峰。
• 高选择性 — 荧光的高选择性当然是有利的；然而，由于天然发出荧光的分子非常少，因此高选择性也可能是缺点，其阻碍了荧光在分子光谱的各个领域中得到轻松且广泛的应用。

荧光淬灭是指荧光团与另一种化合物（可能是同种分子，也可能是完全不同的化合物）相互作用，导致荧光减弱的过程。这一过程非常复杂，但简单来说，溶液中的分子越多，就越有可能发生淬灭。当样品达到一定浓度，淬灭作用显著时，荧光强度会随着浓度的增加而降低。

如果样品的吸光能力非常强，意味着所有入射光都会在样品池的前表面附近被吸收，这种情况下就会出现荧光内滤效应。光完全被样品的一小部分吸收，导致样品不会如预期那样整体发射荧光，由此测得的荧光强度也不能体现出样品的真实浓度。由于对激发光的吸收而导致荧光强度降低的现象通常称为一级内滤效应。此外还存在二级内滤效应 — 在高浓度样品中，发出的荧光信号也可能被其他同类型的荧光团吸收。在样品内部被吸收的荧光不能到达检测器，这也会导致浓度与强度之间的关系偏离线性。

有多种方法可以大大降低高浓度样品中的内滤效应。选择样品吸光度较低的波长作为激发波长可以削弱一级内滤效应。在 Cary Eclipse 荧光分光光度计中，可使用小体积样品池和三角样品池缩短光程，从而降低样品的吸光度。Cary Eclipse 固体样品支架允许操作人员调整样品池的位置，尽可能增加从样品池正面进入光谱仪光学系统的发射光子数（“正面”设置）。同样，这也可以缩短光程，削弱一级和二级内滤效应。

分子的荧光寿命（或磷光寿命）是激发和光子发射之间的平均时间，或者分子在激发态下存在的平均时间。寿命通常不受样品浓度、淬灭或内滤效应的影响，因此可与荧光强度一同用作评估参数。即使待测样品处于高荧光背景的混合物中（在生物样品中非常常见），也可以确定其荧光寿命。荧光寿命检测可用于表征样品混合物中的各种荧光物质，这种方法在蛋白质的生物物理研究中发挥着重要作用。

磷光和荧光一样，是一种光致发光 — 分子从电子激发态弛豫回到基态而发射出光子。然而，荧光是一个极其短暂的过程（通常只持续数纳秒），而磷光材料通常发光更久（从数微秒到数分钟，甚至数小时）。

正如先前的常见问题解答中所述，其原因在于：荧光过程属于“允许”跃迁，而磷光过程则属于“禁阻”能态跃迁。“禁阻”并不意味着不能发生，只是需要的时间更长。一些分子还表现出延迟荧光。在延迟荧光中，发射过程（荧光）是一个允许过程，但发射是延迟的，比如可以在一些镧系元素中观察到此现象。

磷光标记物和延迟荧光标记物常用于标记生物分子。在进行磷光或延迟荧光检测时，检测到发射光的时间与激发的时间之间存在很大的时间差。这一特性提供了极大的优势，因为它提供了一种可靠的机制，可用于消除常见的背景荧光干扰（来自细胞或介质的自体荧光）。背景荧光干扰通常会让这类分析变得更复杂，会干扰常用探针（例如荧光素和罗丹明）的稳态发射，同时也是造成高背景信号的主要原因。

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计可以在同一次测量中检测样品的直接发射（纳秒级的荧光）和磷光发射（毫秒级），使科研人员能够同时研究生物分子样品和镧系荧光标记物的发射。

Cary Eclipse 可以在荧光、磷光、化学发光和生物发光检测模式之间轻松切换，无需更改任何硬件。

了解更多信息：

• 技术概述 — 使用 Cary Eclipse 荧光分光光度计进行时间分辨测量

在大多数情况下，光致发光是一种荧光过程。如果“跃迁”（从高能态返回低能态）是一个“允许的过程”，则称发光为荧光。如果跃迁是一个“禁阻的过程”，则称发光为磷光。禁阻并不意味着不能发生，只不过不如允许跃迁的过程那样容易发生。而且禁阻的过程耗时更长，这就是磷光化合物的寿命比荧光化合物的寿命长得多的原因。

注意：化学发光、生物发光和电致发光既可以是荧光也可以是磷光，但这种区分并不那么重要。

化学发光是由化学反应产生的光发射。从技术层面来讲，化学发光不属于光致发光，因为其中不涉及吸收激发光子达到激发态的过程。在化学发光中，激发态是通过化学反应达到的。这可能是由于化学品发生混合，比如在荧光棒中。

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计可以在荧光、磷光、化学发光和生物发光检测模式之间轻松切换。

了解更多信息：

• 应用简报 — 使用 Cary Eclipse 检测来自钌络合物的化学发光

生物发光是指由生物体产生的光，属于化学发光的一种。生物发光是生物化学反应的结果，在水母和萤火虫等物种中很常见。

Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计可以在荧光、磷光、化学发光和生物发光检测模式之间轻松切换。

了解更多信息：

• 期刊论文 — Bioluminescent and Structural Features of Native Folded Gaussia Luciferase, E. S. Vysotski et al., Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, (183) June 2018, 309