Access Agilent 电子期刊（2015 年 8 月）

使用配备三重四极杆质谱检测器的 Agilent SFC/UHPLC 混合型系统对手性和非手性代谢物进行快速准确的分析

作者：Siji Joseph
安捷伦应用科学家

使用液质联用系统进行的代谢物分析常常因为代谢物的立体异构体和区域异构体的形成而具有更大的挑战性。对单个异构体进行峰与峰的色谱分离是进行更准确的痕量代谢物手性与非手性质谱分析的优选策略。而反相高效液相色谱 (HPLC) 是非手性分析的最佳分离方法。超临界流体色谱 (SFC) 也可以实现非手性或手性分析的快速分离，且比其他常规正相分离更具优势。为最大程度利用这些方法，Agilent 1260 Infinity 分析型混合 SFC/UHPLC 系统提供了 SFC 和 RPLC 模式之间的无缝方法切换。

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图 1. Agilent 1260 混合 SFC/UHPLC 系统的仪器示意图。

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图 2. 使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 苯基-己基 (2.1 x 150 mm, 1.8 µm) 色谱柱通过反相液相色谱进行非手性分离（代谢物 MRM 离子对已示出）。

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图 3. 使用 Zorbax RX-SIL (4.6 x 150 mm, 5 µm) 色谱柱进行非手性 SFC 分离（代谢物 MRM 离子对已示出）。

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图 4. (A) 使用 CHIRALPAK OD-3 (3.0 x 100 mm, 3 µm) 色谱柱对 100 ng/mL 混标进行手性 SFC 分离。每个代谢物的异构体均已标出。(B) 将 Zorbax RX-SIL 色谱柱与 CHIRALPAK OD-3 色谱柱串联使用后，混标的手性 SFC 分离得到改善。将 Zorbax A 与 CHIRALPAK OD-3 色谱柱串联使用后，6-、7- 和 8-羟基华法令异构体的分离得到了明显改善。所有代谢物和华法令的 MRM 离子对均已标出。

在下面的例子中，我们展示了使用 Agilent 1260 Infinity 分析型混合 SFC/UHPLC 系统与 Agilent 6460 QQQ 系统对华法令氧化代谢物的立体异构体和区域异构体进行的非手性和手性分析。我们采用该系统的反相液相色谱模式，对华法令及其 5 种羟基化代谢物进行了非手性分离。然后，在 SFC 模式下进行了手性和非手性分离。Agilent 6460 QQQ 确保了对所有亚纳摩尔水平的羟基华法令异构体的检测。

通过安捷伦解决方案实现自动化方法切换和更高的灵敏度

RPLC 和 SFC 之间的自动化方法切换可通过 Agilent MassHunter 软件控制的 2 位/10 通阀实现，无需进行任何手动硬件重新配置。该仪器示意图显示于图 1 中。柱温箱中配备有一个附加的 2 位/6 通柱切换阀，以便为每种模式轻松选择相应的色谱柱。在仪器配置中额外增加一个二元泵，提供辅助液流，可提高离子化效率。在将样品进样至 QQQ 仪器之前，还安装了液流分流器，使色谱柱洗脱液的一部分直接进入 QQQ，另一部分则进入 SFC 模块的反压调节器 (BPR)。从而避免了通过 BPR 的峰展宽。用 Agilent 6460 三重四极杆质谱仪对 RPLC 和 SFC 分离得到的分析物进行检测。电喷雾离子源配置了可提高灵敏度的安捷伦喷射流 (AJS) 热梯度聚焦技术，并在正离子模式下操作。选择华法令及其代谢物的质子化 [M+H]+ 离子作为 MRM 采集的母离子。

使用 Agilent ZORBAX 色谱柱实现出色的非手性反相分离

在本实验中，我们采用了混合 SFC/UHPLC-QQQ 系统的 RPLC 模式，并使用窄径苯基-己基柱进行初步的非手性反相分析。可观察到，华法令及其所有 5 种羟基化代谢物均得到了良好的基线分离（图 2）。

使用 Agilent ZORBAX RX-SIL 色谱柱实现完美的非手性 SFC 分离

使用 Agilent Zorbax RX-SIL 色谱柱进行的非手性 SFC 分析实现了对华法令及其所有 5 种羟基化代谢物的完美分离（图 3）。使用 RPLC 和 SFC 分析的互补策略可以从华法令及其代谢物的相反洗脱顺序中明显看出。与 RPLC 相比，SFC 提供了更短的分析时间。

串联多供应商仪器优化手性 SFC 分离

使用 CHIRALPAK OD-3 色谱柱的手性 SFC 分析能够对羟基华法令的所有 5 种区域异构体和立体异构体的对映异构体进行分离。但有几个异构体峰不能实现基线分离。我们将 Agilent Zorbax RX-SIL 与 CHIRALPAK OD-3 色谱柱串联，为所有 5 种羟基华法令的区域异构体及华法令提供了更好的分离度（图 4）。SFC 模式下的低色谱柱背压 (< 260 bar) 为多种色谱柱固定相的联用提供了更高的灵活性，并增加了分离的正交性。

针对手性药物代谢研究的无缝、灵活的解决方案

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图 1.

Agilent 1260 混合 SFC/UHPLC 系统的仪器示意图。

图 2.

使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus 苯基-己基 (2.1 x 150 mm, 1.8 µm) 色谱柱通过反相液相色谱进行非手性分离（代谢物 MRM 离子对已示出）。

图 3.

使用 Zorbax RX-SIL (4.6 x 150 mm, 5 µm) 色谱柱进行非手性 SFC 分离（代谢物 MRM 离子对已示出）。

图 4.

(A) 使用 CHIRALPAK OD-3 (3.0 x 100 mm, 3 µm) 色谱柱对 100 ng/mL 混标进行手性 SFC 分离。每个代谢物的异构体均已标出。(B) 将 Zorbax RX-SIL 色谱柱与 CHIRALPAK OD-3 色谱柱串联使用后，混标的手性 SFC 分离得到改善。将 Zorbax A 与 CHIRALPAK OD-3 色谱柱串联使用后，6-、7- 和 8-羟基华法令异构体的分离得到了明显改善。所有代谢物和华法令的 MRM 离子对均已标出。