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用于基因工程的 CRISPR-Cas9 — 详细信息与性能指标

CRISPR-Cas9 系统正迅速成为应用最广泛的技术之一，不断推动基因工程、合成生物学和功能基因组学取得新进展。CRISPR/Cas 之所以被广为接受，是由于其具有无与伦比的特异性，并且我们可以在不降低活性或保真度的条件下轻松操纵这种特异性。研究人员一开始认为细菌免疫系统是一个不太可能的假设，而现在它即将成为基因组工程和合成生物学的基石。

细菌有免疫系统？

当 1987 年首次发现规律成簇的间隔短回文重复 (CRISPR) 时，它们的功能还是一个谜[1]。后续研究发现许多原核生物基因组都存在这样的重复位点[2]，它们与保守的 Cas 基因相连[3,4]，间隔序列与质粒序列和病毒序列同源[5-7]，以及 CRISPR 小 RNA 的转录[8]。这些发现形成了这一假设，即 CRISPR-Cas 系统包含限制病毒和质粒传播的遗传干扰机制[9]，这一预测后来得到了实验验证[10,11]。

天然的 CRISPR/Cas 系统有两个遗传成分：一个包含 Cas 基因的操纵子，以及 CRISPR 序列（其包含由相同的重复序列分隔的“间隔”序列）。在对感染的反应中，Cas 操纵子作为信号级联反应的一部分被激活。Cas 蛋白将外源 DNA 的短片段作为间隔序列整合到 CRISPR 序列中[22]。它们成为基因组的重要组成部分，提供了对之前感染的遗传记忆。其他 Cas 蛋白启动针对病毒或细菌入侵时外源 DNA 的防御机制。首先，由 CRISPR 序列转录较长的前体 (pre-cRNA)。然后 Cas 核酸酶在其重复序列处切割生成较短的 CRISPR RNA (crRNA)。这些小的 crRNA 与之前储存在 CRISPR 序列中的外源 DNA 序列互补，并由 Cas 核酸酶结合在一个复合体中，使入侵的 DNA 降解，抵御感染。

Cas-9 和 tracrRNA

研究表明，CRISPR/Cas 系统共有三种类型[12]，但由于 II 型系统在体内和体外都可以高效地切割 dsDNA，并且比其他类型使用的组件更少，其成为了基因操作应用的首选。II 型系统通过一个小的反式激活 crRNA (tracrRNA) 来处理 pre-crRNA，tracrRNA 与 pre-crRNA 中的重复序列互补。II 型系统中的 Cas9 DNA 核酸酶识别 tracrRNA 和目标 crRNA 之间形成的 RNA 螺旋，引导 Cas9 到达目标 DNA。因此，利用 crRNA 和目标 DNA 之间的沃森-克里克碱基对，Cas9 的切割具有高度的位点特异性。crRNA 中的一个称为前间区序列邻近基序 (PAM) 的短序列，即化脓性链球菌 (S. Pyogenes) 中的 5’-NGG，处于与目标 DNA 互补区域的下游，也是切割所必需的序列。tracrRNA 和 crRNA 碱基配对形成的 RNA 复合体是该系统的重要组成部分。然而，2012 年的研究表明，单向导 RNA (sgRNA) 可以替代这两种成分[13]。这一发现极大地扩展了 CRISPR-Cas9 在基因修饰方面的易用性和灵活性，并催生了大量的应用。

用 gRNA 开启 CRISPR-Cas9 的强大功能

虽然 tracrRNA：crRNA 的靶点选择机制在自然界中是有效的，但是嵌合 sgRNA 引导的 Cas9 系统简化了 DNA 切割的定制编程。sgRNA 将 crRNA 的 3’ 端与 tracrRNA 的 5’ 端融合，模仿 tracrRNA：crRNA 复合体的 RNA 结构。这一 sgRNA 概念使系统得以简化，减少了利用 CRISPR/Cas 作为基因工程工具所需的组件数量。tracrRNA 序列固定在 CRISPR-Cas9 系统中，但 cRNA 序列区域可以改变，以靶向基因组中任何目标区域。利用体外转录 (IVT) 可以将寡核苷酸合成或构建成 sgRNA。安捷伦的大规模并行寡核苷酸合成技术使 CRISPR-Cas9 基因工程能够充分发挥其潜力，以可承受的成本使用数千种不同的 sgRNA 序列（单个或在一个综合文库中），从而满足任何基因修饰实验的需求。

设计 gRNA 的技巧：

  • 使用生物信息学工具将脱靶双链断裂的概率降到最低 — 根据经验测试多个 sgRNA 序列可以帮助优化结果。
  • 当创建小的插入缺失时，可以靶向任意一条 DNA 链。然而，靶点应更靠近蛋白质的 N 端而非 C 端，以最大可能地获得一个真正的无效等位基因。
  • 当靶向 dsDNA 断裂进行同源重组 (HR) 修复时，确保剪切位点距离修复模板近端大于 30 个核苷酸，以使效率最大化。


利用 CRISPR 和 Cas9 靶向和编辑基因组

自 2012 年的研究表明 Cas9 可进行编程用于在体外切割 DNA 位点后，大量论文证明了该平台可以应用在多种细胞和生物体中[14]。最初，它被用来靶向细菌、人类癌细胞系、多能干细胞和动物模型（斑马鱼）的内源性基因。此后，Cas9 被用于修饰酵母[15]、烟草[16]、拟南芥[16]、水稻[17]、小麦[17]、高粱[18]、小鼠[19]、兔[20]、青蛙[21]、果蝇[22]、蚕[23]和蛔虫[24] 中的基因。最近，CRISPR-Cas9 系统被用于精确编辑食蟹猴[25] 基因。

成功的关键之一是 Cas9 能够促进大于 5 kb 的 DNA 片段的克隆，而通过 PCR 则不能克隆大于 5 kb 的 DNA 片段。经过纯化的 Cas9 酶还可以通过选择性地切割 SNP 或野生型位点进行 QPCR 定量，对嵌合体中 SNP 频率进行定量。

CRISPR/Cas 系统具有一个独特的优势，与巨核酶、锌指核酸酶 (ZFN) 以及转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 不同，它能够轻松地并行修饰多个位点[14]。通过结合使用多种 gRNA，可以用它在大鼠细胞[26]、小鼠 ES 细胞[27] 和斑马鱼体细胞[28] 中诱导小的和大的缺失或倒位以及同时引入多个基因的突变。

使用较大的 gRNA 文库，这种多重方法可以扩展至组学水平。这些文库可以包含宿主生物中几乎每个基因的多个 gRNA，以前所未有的规模推进基因筛选。高达 122 k 的含有不同 gRNA 的文库已经被用于人类和小鼠细胞的表型筛选[29-31]。这一类型的系统筛选相比 RNAi 技术（在表达水平诱导非永久性变化）是一种优势，CRISPR-Cas9 通过修饰基因组实现了真正的基因敲除[32]。与 RNAi 相比，CRISPR/Cas 还具有靶向非编码区的优势，它可以提供一致性和重现性更好的结果。

 

参考文献

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仅限研究使用。不可用于诊断目的