全球 TOP10 制药巨头都在用二维液相做什么？

随着药物研发难度日益加大，分子结构的复杂性、生产工艺的发展都对分析技术提出了新的挑战。比如抗体/ADC 等生物制药复杂的结构异质性、多手性中心的对映异构体分子分离、生物药的连续流生产的在线过程分析（PAT）等，这些挑战都是常规一维色谱技术无法解决，或需要牺牲时间/人工成本和数据质量。

本文将从全球 TOP10 制药巨头：瑞士 Roche（罗氏）、Novartis（诺华）和美国 Merck & Co (默沙东)、BMS（百时美施贵宝）发表的二维文献和相关讲座中，为您寻找这些问题的答案。

这些文献和讲座涉及以下应用方向：

单抗多 CQA 同时分析用于细胞株筛选；在线过程分析（PAT）
自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
ADC 多 CQA 分析方法专属性验证
二维液相用于杂质质控可行性分析-基于 AQbD 的方法验证
多手性中心对映异构体分离

四大药企简介

多手性中心对映异构体分离 Merck 和 BMS 虽然不是销售额排名最靠前美国药企，但由于他们的 PD-1 单抗 K 药 Keytruda（Merck & Co）和 O 药 Opdivo（BMS），成为当下被谈论最多的两家企业。根据 EvaluatePharma 发布的 2021 全球医药市场展望，作为全球第一款 FDA 批准的 PD-1 单抗，BMS 的 O 药销售额将突破 88 亿美金，而后来居上的K药将在2023年接棒阿达木单抗，成为新一代药王。[1]

多手性中心对映异构体分离 Roche 和 Novartis 总部均位于瑞士巴塞尔，2019 年处方药销售全球排名第 1 和第 2 名（据 EvaluatePharma 统计），而他们的发展轨迹确截然不同[1]。Novartis 起源于瑞士的汽巴、嘉基、山德士三家化工巨头，产品管线丰富。目前热门的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T），Novartis 是拥有首个 FDA 批准的此类疗法。Roche 是制药巨头中生物制药占比最高公司之一， 80% 以上销售额来自其Biotech产品。Roche 是最会买的公司之一， Roche 的王牌肿瘤药利妥昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(Herceptin)、贝伐株单抗 (Avastin) 均出自其收购的基因泰克 (Genentech）公司[2]。

大分子

Merck & Co：单抗多 CQA 同时分析用于细胞株快速筛选

聚集体会影响单抗的生物效价、稳定性、安全性，因此聚集体分析是单抗生产工艺开发中最常见的分析。快速的、无需前处理的分析方法将提高细胞株筛选、工艺优化的效率。

Merck & Co.与 Agilent Thought Leader (安捷伦思想领袖奖) 获得者 Dwight R. Stoll 教授合作，基于 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 ASM-MHC 模式（主动溶解调制多中心切割二维液相）开发了快速 Protein-A X SEC 二维方法，分析已收获的细胞培养液（harvested cell culture fluid samples）中目标单抗的滴度和聚集体；分析时间仅需 5 分钟。系统考察了方法的回收率、分离度、准确度、精密度，证明快速 Protein-A X SEC 二维方法是个高效的、高通量的筛选工具。[3]

图 1. 测定 HCCF 中单抗聚集体含量的工作流程。快速 Protein-A X SEC 二维液相法无需手动 PAP 分离工作[3]

BMS：二维液相进行抗体生产在线过程分析（PAT）

在线过程分析（PAT）通过及时测量影响关键质量属性（CQA）的关键过程参数（CPP）来设计、分析和控制生产过程。PAT 可以增强对工艺和产品的理解，以确定设计空间，尤其是在连续流工艺中意义更加重大。PAT 有助于提高产品质量、批次间重复性、效率和灵活性，最大化节约制造空间，优化工艺过程和稳定性，节约资本投入和运营成本。

对于结构异质性复杂的抗体类药物，传统方式进行 Pro-A 净化前处理，再进行聚集体、电荷异质性等色谱分析，无法满足在线、实时 PAT 的需求。BMS 的研究人员使用 SegFlow 与 Agilent InfinityLab 2D-LC 联用技术，实时在线分析生物反应器培养基氨基酸、单抗和融合蛋白类药物的滴度和关键质量属性，实现细胞培养过程的代谢平衡和调控。

图 2. Agilent 与 LCGC 邀请 BMS 专家举办的关于二维液相进行抗体生产在线过程分析（PAT）的讲座

Roche：自动化单抗结构异质性表征-在线酶切

通常 mAb 分子量大约 150Kd，IEC 分析电荷异质性时，如果直接完整蛋白除盐进入高分辨质谱，往往只能看到质量数变化比较大的异质性，但是对于质量数变化很小的变异（比如脱氨，分子量变化只有 1Da ），完整蛋白水平很难准确分析判断。

Roche 研发人员基于安捷伦液相模块搭建的“四维”系统（4D HPLC/MS），可以对离子交换电荷异质体进行在线酶切肽图分析，能够清晰的看到脱氨基、氧化等 PTM 带来的电荷酸碱变异。[4]

4D HPLC/MS 在线除盐酶切系统：一维 IEC 分离 mAb 电荷异质体；二维反相捕获、还原；三维在线胰酶酶切；四维 Peptide Mapping 进入 MS 分析。

图 3. 4D LC/MS工作流程简图 [4]

Novartis – ADC 多 CQA 分析方法专属性验证

抗体偶联药物 ADC 发展至今，已经历了三代，近年来广受关注，2017-2020 共 8 个产品获批。ADC 药物的关键质量属性 CQA 包括：高分子量组分 HMWS，药物抗体偶联比 DAR，载药量分布，未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药含量等。

Novartis 研究人员开发了梯度 SEC 方法用于分离 ADC、高分子量组分 HMWS、未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药。并使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 MHC 模式（多中心切割二维）进行了方法专属性验证，证明他们开发的梯度 SEC 方法的分离效果；同时研究了梯度 SEC 方法和 SEC X RPLC 方法的精密度和回收率；两者精密度均在 0.01%-3.68% 之间，回收率在 82%-107% 之间。[5]

图 4. ADC 药物的 SEC X RPLC 二维定量分析[5]

小分子

Merck & Co -小分子：多手性中心对映异构体分离

结构高度相似化合物的分离分析是现代药物的最大挑战之一，比如对映异构体的分析。新开发的小分子药物绝大多数含有手性中心，而且多手性中心药物的开发也已成为一个新的趋势。多手性中心对映异构体，几乎不可能通过一根单一分离机制的色谱柱实现所有异构体的分离。

Merck & Co 研究人员使用 Agilent InfinityLab 2DLC 的 MHC 模式（多中心切割二维）研究单手性中心药物法华林和代谢产物羟基法华林的分离，使用反相X手性色谱柱的模式，在第一维实现原型和代谢产物的分离，第二维实现手性分离。使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 Comprehensive 2D-LC 模式（全二维），采用手性 X 手性色谱柱的模式，实现了多中心药物合成过程中异构体的分析。研究工作作为封面文章，发表在 Analytical Chemistry 杂志上。[6]

图5. Merck & Co 使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 在 Analytical Chemistry 上发表的封面文章[6]

Genentech：二维液相用于 QC 的可行性

二维液相在分离上的优势有目共睹，但这种技术是否足够稳定，是否可以应用于 GMP 环境下的 QC 分析呢？

Genentech 使用安捷伦单中心切割二维液相，基于 QbD 理念，通过 DoE（实验设计）考察了关键方法参数 CMPs（中心切割的关键因素：进入 2D 的馏分组成（pH、有机相比例) 及 loop 环的填充比例）的设计空间 MODR 和操作空间 PAR，对关键方法属性 CMAs 进行验证，以证明二维在 GMP 环境中的质控可行性。[7]

图 6. 通过 QbD 软件进行二维分离三大关键变量设计空间的确认[7]

安捷伦二维液相方案，改变你的色谱分析

以上案例诠释了安捷伦二维液相方案在解决不确定性问题、复杂样品的完整信息、和复杂处理自动化等方面的优势。

安捷伦自 2012 年推出市场第一款商品化二维液相产品以来，一直在该领域持续创新。产品也被世界 TOP 药企广泛认可，并应用于药物研发工作。

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